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Nature Metabolism volumen 5, páginas 80–95 (2023)Cite este artículo

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La aciduria metilmalónica (MMA) es un error congénito del metabolismo con múltiples causas monogénicas y una patogénesis poco conocida, lo que lleva a la ausencia de tratamientos causales eficaces. Aquí empleamos perfiles ómicos de múltiples capas combinados con características bioquímicas y clínicas de individuos con MMA para revelar un diagnóstico molecular para 177 de 210 (84%) casos, la mayoría (148) de los cuales muestran variantes patogénicas en la metilmalonil-CoA mutasa ( MMUT). La estratificación de estas capas de datos por gravedad de la enfermedad muestra una desregulación del ciclo del ácido tricarboxílico y su reposición (anaplerosis) por la glutamina. La relevancia de estas alteraciones se evidencia en la metabolómica multiorgánica de un modelo de ratón Mmut hemicigótico, así como en la identificación de interacciones físicas entre MMUT y las enzimas anapleróticas de glutamina. Utilizando el rastreo de isótopos estables, encontramos que el tratamiento con dimetiloxoglutarato restablece el ciclo deficiente del ácido tricarboxílico. Nuestro trabajo destaca la anaplerosis por glutamina como un posible punto de intervención terapéutica en MMA.

Los errores congénitos del metabolismo (MEI), descritos por primera vez por Archibald Garrod1, son enfermedades hereditarias resultantes de la función inadecuada de las proteínas metabólicas. Las IEM representan un grupo de casi 1.500 enfermedades con una incidencia combinada de aproximadamente 1:800 nacimientos. Presentan un cuadro clínica y genéticamente heterogéneo que los hace inherentemente difíciles de diagnosticar2,3. Más allá de sus desafíos de diagnóstico, los mecanismos patogénicos de muchos IEM no se comprenden bien; por lo tanto, la mayoría de los IEM carecen de enfoques de tratamiento racionalizados4.

La aciduria metilmalónica (MMA) es un EIM prototípico que puede ser causado por defectos en aproximadamente 20 genes5. La MMA aislada clásica es un trastorno autosómico recesivo causado por variantes patogénicas en los genes MMUT, MMAA y MMAB, con una prevalencia de aproximadamente 1:90.000 nacimientos6. Los productos genéticos de MMAA y MMAB convierten la vitamina B12 intracelular (cobalamina, Cbl) en su forma de cofactor (adenosilcobalamina, AdoCbl), que es utilizada por la metilmalonil-CoA mutasa (MMUT) para la descomposición de metilmalonil-CoA en succinil-CoA como parte del catabolismo del propionato. La disfunción de cualquiera de estas proteínas conduce a la acumulación del metabolito del mismo nombre, ácido metilmalónico, y otros. Clínicamente, los individuos con MMA aislada clásica frecuentemente presentan retraso del crecimiento y episodios agudos potencialmente mortales en el período neonatal, que involucran vómitos y deterioro de la función neurológica (estado comatoso y accidente cerebrovascular metabólico) acompañados de alteraciones bioquímicas (acidosis metabólica e hiperamonemia)7. Los pacientes supervivientes con MMA se ven afectados por complicaciones a largo plazo que incluyen principalmente anomalías neurológicas (trastornos del movimiento y deterioro intelectual), insuficiencia renal y anemia/neutropenia7. Aunque la (dis)función de MMUT se ha estudiado ampliamente8,9,10,11, las principales alteraciones metabólicas y patomecanismos de la MMA siguen siendo una cuestión abierta y no hay opciones de tratamiento curativo disponibles.

Los avances tecnológicos en genómica y espectrometría de masas, que aprovechan conjuntos de datos de clases de moléculas completas (ómicas), han llevado recientemente a un cambio de paradigma en su uso como herramientas de diagnóstico. Por ejemplo, la WGS de una sola capa ha logrado tasas de diagnóstico del 30 al 50 % en cohortes de enfermedades raras12,13,14, mientras que la combinación de doble capa con secuenciación de ARN (RNA-seq) puede mejorar esto entre un 10 y un 35 %15,16. 17,18. A pesar de estos avances, un número sustancial de pacientes con IEM siguen sin diagnosticarse y la predicción del curso de la enfermedad sigue siendo deficiente, principalmente debido a una falta de comprensión patomecánica y, a menudo, a relaciones poco claras entre genotipo y fenotipo.

Los datos ómicos de múltiples capas tienen el potencial no solo de aumentar las tasas de diagnóstico de los IEM, sino también de descubrir conocimientos mecanicistas sobre la fisiopatología de la enfermedad19, lo que podría indicar nuevos objetivos terapéuticos. Este enfoque combinatorio es clave para ir más allá de la visión tradicional de estos trastornos de "un gen, una enfermedad", que no logra explicar la heterogeneidad fenotípica basada únicamente en la variación genética; sin embargo, la aplicación simultánea de tecnologías multiómicas para este fin no se ha probado rigurosamente y se desconoce su verdadera utilidad, sus obstáculos y sus lagunas de conocimiento.

Al combinar la secuenciación del genoma completo (WGS), la secuenciación del transcriptoma completo (RNA-seq) y la información de proteotipado (espectrometría de masas de adquisición independiente de datos (DIA-MS)) con características fenotípicas, identificamos características patogénicas y causantes de enfermedades en una cohorte de Individuos afectados por MMA. Revelamos variantes dañinas subyacentes y transcripciones y proteínas expresadas diferencialmente directamente relacionadas con la anaplerosis del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). Además, los estudios de seguimiento que utilizaron metabolómica no dirigida y rastreo de glutamina [U-13C] revelaron un agotamiento de la anaplerosis del ciclo de TCA en línea con la desregulación identificada de las enzimas glutamato deshidrogenasa y oxoglutarato deshidrogenasa, que encontramos que interactúan físicamente con un complejo de proteínas. incluyendo MMUT. Más allá de revelar estas alteraciones metabólicas en la deficiencia de MMUT, nuestros hallazgos permiten una mejor comprensión biológica de la anaplerosis del ciclo de TCA. Además, la insuficiencia anaplerótica del ciclo de TCA en MMA puede ser un posible punto de intervención terapéutica, como lo demuestra el aumento de los grupos intermedios del ciclo de TCA y la reducción de los metabolitos tóxicos específicos de MMA mediante el tratamiento con dimetiloxoglutarato.

Para ampliar la comprensión de MMA desde las lesiones genómicas causantes hasta los procesos bioquímicos afectados, realizamos proteotipos basados ​​en WGS, RNA-seq y DIA-MS de alta calidad en fibroblastos tomados de 230 individuos (210 afectados por MMA y 20 no afectados). que representa una cohorte principalmente europea recopilada durante 25 años (Fig. 1a y Datos ampliados Fig. 1). El ensayo bioquímico de la incorporación de propionato (PI)20 y la actividad de la enzima MMUT8 estuvo fuertemente correlacionado en todas las muestras (rho = 0,73, P <0,0001) (Datos ampliados, figura 2a). Los fibroblastos de 150 individuos con MMA tuvieron una actividad MMUT reducida (deficiente en MMUT), incluidos 123 que no aumentaron con la suplementación con cofactor (Datos ampliados, Fig. 2b, c), mientras que los de 60 individuos tuvieron una actividad MMUT similar a los controles (otra MMA). (Figura 1b).

a, Descripción general del estudio con una descripción de la vía del propionato, incluidos sus precursores y las vías catalizadas por MMUT. b, actividad de la enzima MMUT por subcohorte de estudio (MMUT deficiente, n = 150; otras MMA, n = 60; no afectado, n = 3); Los valores de p se calcularon mediante la prueba de rango de Wilcoxon, bilateral. c, Gráfico Lollipop de todas las variantes patogénicas encontradas en el gen MMUT. d, Proporciones de tipos de variantes identificadas en el gen MMUT. e, f, Transcripción y niveles de proteína de MMUT por subcohortes de estudio (número de muestras para la transcripción y el gráfico de proteínas, respectivamente: MMUT deficiente, n = 143/150; otros MMA, n = 59/60; no afectado, n = 19/20). g, el gen se clasifica según los valores de P calculados mediante la prueba t de Welch genética (bilateral) en los datos de proteómica y transcriptómica. h, Gráfico Lollipop de variantes patógenas identificadas en ACSF3. i, Proporciones de genes afectados identificados en toda la cohorte. Los valores de p se calcularon mediante la prueba de rango de Wilcoxon. Los elementos del diagrama de caja representan la línea central y la mediana; límites de caja, cuartiles superior e inferior; bigotes, rango intercuartil 1,5×; y puntos, valores atípicos en e y f. Los puntos en b,e,f representan muestras biológicamente independientes.

Datos fuente

En las muestras con deficiencia de MMUT, buscamos en el conjunto de datos WGS variaciones que causan enfermedades en el gen MMUT e identificamos la causa molecular de la enfermedad en 148 de 150 individuos (Tabla complementaria 1). Las variantes patógenas constituyeron 165 alelos sin sentido, 105 alelos truncados, 21 alelos de empalme, 2 alelos con eliminaciones en el marco y 3 alelos que contenían variantes de número de copias (Fig. 1c, d y Datos ampliados, Fig. 2d), de los cuales 41 variantes eran nuevas. (Tabla complementaria 1). RNA-seq identificó una expresión reducida de ARN de MMUT en células de individuos con deficiencia de MMUT en comparación con los otros grupos (Fig. 1e). Los individuos con expresión de ARN fuertemente reducida se enriquecieron para empalmar y/o truncar variantes, lo que es consistente con una descomposición mediada por sin sentido (Datos ampliados, Fig. 2e). Las mediciones del proteoma basadas en DIA-MS revelaron niveles reducidos de proteína MMUT en fibroblastos primarios deficientes en MMUT (Fig. 1f), que se distribuyeron en todos los tipos de variantes (Datos ampliados, Fig. 2e). De acuerdo con su función causante de enfermedades, los niveles de proteína y ARN de MMUT se asociaron positiva y significativamente con la actividad de PI y MMUT (Datos ampliados, figura 2f), sin truncar o empalmar alelos que impulsen esta correlación (Datos ampliados, figura 2g). MMUT representó el ARN y la proteína más significativamente desregulados de las muestras con deficiencia de MMUT en comparación con todas las demás muestras (Fig. 1g y Datos ampliados Fig. 2h).

En las 60 muestras restantes, identificamos variantes bialélicas que causan enfermedades para 22 individuos en genes distintos de MMUT: ACSF3 (17 individuos) (Fig. 1h), TCN2 (3 individuos), SUCLA2 (1 individuo) y MMAB (1 individuo) según la clasificación ACMG (Tabla complementaria 1). Al buscar en RNA-seq genes expresados ​​de manera aberrante usando OUTRIDER21 (Datos extendidos, Fig. 3), identificamos dos individuos con una expresión de ACSF3 muy baja; dos con expresión aberrante de SUCLA2, en quienes confirmamos las variantes predichas de empalme y número de copias a nivel genómico (Tabla complementaria 1); dos con muy baja expresión de MMAA, confirmada mediante análisis de complementación; y uno con transcripción baja de MMAB, también confirmado mediante análisis de complementación. Por lo tanto, identificamos una causa molecular para 29 de los 60 individuos restantes (48%), incluidas 18 mutaciones patogénicas, de las cuales 10 eran nuevas (Tabla complementaria 1). En resumen, encontramos un diagnóstico para 177 de 210 (84%) individuos afectados (Fig. 1i), incluidos 150 con deficiencia de MMUT y 19 con variantes dañinas en ACSF3, lo que representa la cohorte más grande de deficiencia de ACSF3.

Esperábamos que los fundamentos genéticos identificados anteriormente solo predijeran parcialmente los fenotipos clínicos y bioquímicos de los individuos afectados, como otros factores genéticos (por ejemplo, la combinación de alelos patógenos y regulación genética) o no genéticos (por ejemplo, interacciones proteína-proteína). podría influir en la manifestación de la enfermedad MMA. Por lo tanto, nuestro objetivo fue establecer una evaluación cuantitativa de la gravedad de la enfermedad mediante la conversión del catálogo de rasgos fenotípicos, en su mayoría semánticos, en variables numéricas clave. En total recogimos 105 variables fenotípicas. Tras la exclusión de nueve características inespecíficas y/o interdependientes (Métodos; Selección de cohortes), generamos una matriz de correlación de variables fenotípicas (n = 96), que abarca síntomas clínicos en el momento de la presentación y durante el curso de la enfermedad (n = 37), tratamientos clínicos y terapéuticos. La respuesta (n = 22), la química clínica de la sangre o los tejidos, incluidas las mediciones de metabolitos (n = 21) y los parámetros bioquímicos in vitro (n = 13), revelaron un conjunto de características (actividad MMUT, PI) que mostraron una fuerte correlación entre muchas variables. (Figuras 2a,b).

a, Matriz de correlación de todas las variables de fenotipo discretas y numéricas continuas. b, Número de rasgos fenotípicos según cinco subcategorías de fenotipo. c, Panel de rasgos fenotípicos seleccionados y su fuerza general para representar la totalidad del conjunto de datos fenómicos (aquí denominado gravedad de la enfermedad) según lo evaluado mediante modelado lineal después de la transformación logarítmica. Cada punto representa el resultado de la regresión lineal contra otra variable fenotípica con el tamaño del efecto (ES) en el eje y y el valor P ajustado de Benjamini-Hochberg resultante (bilateral) en el eje x. La línea curva horizontal indica la densidad de puntos de datos distribuidos a lo largo del eje x. La línea discontinua vertical indica el umbral de significancia (P <0,05). d, Resultados de regresión lineal de la variable actividad PI+ respecto al resto de variables fenotípicas; Valores de P calculados como en c.

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Como las pocas variables identificadas están fuertemente asociadas con muchas características clínicas, postulamos que la mayoría de las características de la enfermedad podrían predecirse bien mediante una o unas pocas variables seleccionadas. Como prueba de principio, establecimos una puntuación de gravedad clínica (CSS), que incorporaba el resultado de cinco características clínicas típicas7 (composición en Métodos), donde una puntuación de 0 representaba la ausencia de estas características típicas de MMA, una puntuación de 1 indicaba MMA leve y una puntuación de 2 o más (máximo 5) indicaron enfermedad de MMA de moderada a grave. La comparación del CSS con todos los parámetros fenotípicos demostró una correlación significativa con 49 variables individuales (Fig. 2c), incluidos muchos síntomas fenotípicos clásicos de MMAuria, como acidosis, hiperamonemia e hipotonía muscular, así como la necesidad de intervenciones dietéticas y farmacológicas ( Datos ampliados Fig. 4a). En particular, el CSS también se correlacionó inversamente con la edad de inicio (Datos ampliados, figura 4b), un parámetro que por sí solo se ha utilizado como indicación de la gravedad clínica22.

El análisis de correlación múltiple identificó que PI en presencia de hidroxocobalamina (PI+) se correlaciona significativamente con 42 características fenotípicas, la mayor cantidad de cualquier variable continua individual (Fig. 2c). Esto contrasta, por ejemplo, con la edad de inicio, que se correlacionó significativamente con sólo 16 parámetros (Fig. 2c). Una inspección más cercana reveló que PI+ estaba inversamente correlacionado con la gravedad de la enfermedad, incluida una correlación positiva significativa con, por ejemplo, el pH o la edad al inicio de la enfermedad y una correlación negativa con, por ejemplo, la concentración de ácido metilmalónico en plasma, la presencia de intervenciones clínicas como la restricción de proteínas y el CSS (Fig. 2d y Datos extendidos Fig. 4c, d). Es de destacar que estas relaciones se conservaron cuando se incluyeron todas las características recopiladas (Figura complementaria 1). Por lo tanto, de acuerdo con su validez como prueba diagnóstica para MMA20, en este estudio se utilizó la variable PI+ como una aproximación de la gravedad clínica de la enfermedad.

Para identificar alteraciones de la expresión de genes, proteínas y vías asociadas a enfermedades, intentamos una evaluación global de la transcripción y la expresión de proteínas integrada con las variables fenotípicas cuantitativas identificadas anteriormente. Como los pacientes con deficiencia de TCN2, SUCLA2 y ACSF3 carecen de la mayoría de los signos y síntomas típicos de la MMA clásica, comparamos las muestras con deficiencia de MMUT con todas las muestras sin deficiencia de MMUT (control).

La investigación de transcripciones y proteínas utilizando patrones de correlación diferencial (método de correlación de Pearson), reducción de dimensionalidad mediante análisis de componentes principales y DESeq2 no produjo de inmediato una agrupación clara de los datos ni diferencias obvias en los patrones de expresión entre los grupos (Figura complementaria 2); sin embargo, el análisis de factores multiómicos23, que integra capas de datos genéticos y datos de proteotipado, identificó vías metabólicas mitocondriales y, en particular, la cadena de transporte de electrones y el ciclo de TCA que se enriquecerán en muestras deficientes en MMUT (Fig. 3a). Con más detalle, se descubrió que las proteínas SLC16A3, CS, MDH2 y OGDH eran los principales impulsores de la variación de este factor particular en los datos de proteotipado dentro de los conjuntos de genes asociados a TCA (Fig. 3b). El análisis discriminante lineal de genes compartidos entre transcriptómica y proteotipación indicó que MMUT es el más fuerte y que SUCLA2, OGDH y PDHB son los principales impulsores de la separación entre muestras deficientes en MMUT y de control (Fig. 3c). Además, el análisis de enriquecimiento del conjunto de genes utilizando estratificación de muestras por gravedad de la enfermedad, tanto por CSS como por PI+, también identificó la fosforilación oxidativa y el ciclo de TCA como vías sobrerrepresentadas en los conjuntos de datos de proteómica (CSS y PI+) y transcriptómica (CSS) (Fig. 3d ).

a, Prueba de enriquecimiento de conjunto de genes utilizando la herramienta de análisis de factores multiómicos (MOFA). Se muestran los valores de P ajustados por Benjamini-Hochberg (bilaterales). b, Estadísticas detalladas de las características de los conjuntos de genes más enriquecidos después de MOFA en los datos proteómicos; Valores de P calculados como en a. c, El modelo discriminante lineal (dividido para asignar datos de entrenamiento y prueba, 0,5) de transcripciones separa los deficientes en MMUT del control impulsado por MMUT y otros genes relacionados con el ciclo de TCA. d, Análisis de enriquecimiento del conjunto de genes basado en la clasificación de ES derivada del análisis de expresión diferencial (también Fig. 4b); Los valores de P se calcularon con el paquete fgsea R. e, Esquema de reproducción de ratones con deficiencia de Mmut. f, Metabolómica no dirigida en tejidos y fluidos corporales de ratón, que muestra diagramas de caja para el análisis de enriquecimiento del conjunto de metabolitos y ácido metilmalónico basado en el conjunto de datos de metabolómica completo. Se identificaron iones que cambiaban significativamente entre las condiciones mutantes y de control mediante una prueba t de dos muestras. El análisis de la ruta se realizó utilizando una lista de iones anotada clasificada según la importancia del valor de P. Los enriquecimientos de las vías se calcularon utilizando las definiciones de las vías metabólicas de KEGG y una prueba hipergeométrica. g, RNA-seq en tejido cerebral de ratón. Diagramas de caja de la abundancia relativa de transcripciones de Mmut y análisis de enriquecimiento del conjunto de genes después del análisis DESeq2; El tamaño del punto representa el número de genes por conjunto. Los valores de p en f y g (diagrama de caja) se calculan mediante la prueba de rango de Wilcoxon, bilateral. Los elementos del diagrama de caja representan la línea central y la mediana; límites de caja, cuartiles superior e inferior; y bigotes, rango intercuartil 1,5×.

Datos fuente

Estos cambios fueron consistentes con los hallazgos en un modelo de ratón hemicigoto de MMA24 (Fig. 3e). La metabolómica no dirigida del cerebro, corazón, riñón, hígado, plasma y orina confirmó niveles elevados del metabolito epónimo ácido metilmalónico en animales mutantes, mientras que el análisis de enriquecimiento de la vía apuntó a vías del ciclo de TCA desreguladas en todos los tejidos y la orina (Fig. 3f). La transcriptómica del tejido cerebral confirmó aún más la reducción esperada del 50% en la transcripción de Mmut de ratones mutantes, junto con el enriquecimiento de la cadena de transporte de electrones y las vías de fosforilación oxidativa (Fig. 3g, Fig. 3 complementaria).

Como los análisis basados ​​en datos y fenotípicamente estratificados indicaron que el TCA y las vías asociadas se alteran en la enfermedad, realizamos una investigación concertada de las enzimas del ciclo del TCA, incluidas aquellas que metabolizan anapleróticas (reponiendo los intermediarios del ciclo del TCA) y catapleróticas (eliminando los intermediarios del ciclo del TCA). reacciones, de las cuales obtuvimos información tanto de ARN como de proteínas. Como controles, incluimos isoformas de enzimas TCA que no están involucradas en estas vías (Fig. 4a). La comparación directa de la expresión de ARN y proteínas entre las células de control y deficientes en MMUT reveló que MMUT estaba significativamente desregulado (Fig. 4a banda exterior).

a, Gráfico de Circos que representa cambios de pliegue sin procesar (FC) de transcripciones y proteínas, tamaños de efectos (ES) derivados del análisis de expresión diferencial, correlaciones transcripción-proteína (rho) y relaciones correlativas de la proteína MMUT con las proteínas TCA y sus isoformas correspondientes. b, los gráficos QQ y de volcán ilustran los resultados del análisis de expresión diferencial basado en un enfoque de modelado lineal mixto aplicado a los datos de proteómica y transcriptómica, restringido a enzimas (o sus genes codificantes) localizados en las mitocondrias; Los valores de P calculados fueron bilaterales. c, Histogramas de correlaciones de Spearman en 4318 pares de transcripción-proteína (izquierda) y 221 muestras (derecha). d, Diagrama de dispersión de las correlaciones de Spearman en MMUT deficiente frente al control. La distancia euclidiana desde la diagonal se calcula según la fórmula (correlación de control deficiente en MMUT)/sqrt(2); Los valores de P calculados fueron bilaterales.

El análisis de expresión diferencial, realizado utilizando un enfoque de modelado lineal mixto25, identificó los genes con el tamaño del efecto más fuerte y la importancia para enriquecerse para la localización mitocondrial, como se enumera en MitoCarta 3.0 (ref. 26) (Figura complementaria 4). Un examen más detallado (Fig. 4a, b banda media), identificó que MMUT estaba significativamente regulado negativamente en la enfermedad tanto a nivel de ARN como de proteína, mientras que ALDH2, que cataliza el intercambio entre metilmalonato y metilmalonato semialdehído, estaba regulado positivamente en ambos. Otro transcrito regulado positivamente fue PDK4 (Fig. 4b), que es responsable de la fosforilación y, como consecuencia, de la inactivación del complejo piruvato deshidrogenasa; sin embargo, las proteínas con el mayor tamaño del efecto general fueron OGDH (regulada negativamente en la enfermedad) y GLUD1 (regulada positivamente en la enfermedad), ambas enzimas involucradas en la anaplerosis de la glutamina (Fig. 4b). De acuerdo con nuestros hallazgos, los estudios proteómicos en hígados de MMA humanos realizados por otros han identificado igualmente GLUD1 y ALDH2 regulados positivamente (ref. 27) y el análisis específico de mitocondrias aisladas derivadas del hígado de un modelo murino de MMA mostró una disminución de los niveles de proteína OGDH y de la actividad enzimática28.

El examen de la correlación de la expresión de ARN-proteína en todas las muestras reveló una correlación de Spearman limitada de 0,14 a nivel genético (4318 pares de transcripción-proteína) y 0,40 a nivel de muestra (Fig. 4c y Datos ampliados Fig. 5a), similar a los hallazgos de otros29. La correlación ARN-proteína en células con deficiencia de MMUT en comparación con los controles reveló que, mientras que 1.158 pares (26,8%) se correlacionaron significativamente (P <0,05) en ambos genotipos (Fig. 4d, todos los puntos coloreados y Datos ampliados, Fig. 5b) de acuerdo con anteriores Estudios30, la correlación de algunos genes segregados según el genotipo (MMUT deficiente versus control) (Fig. 4d). En particular, OGDH, GLUD1, CS y GLS mostraron una mayor correlación ARN-proteína en muestras con deficiencia de MMUT que los controles, mientras que SUCLA2 había reducido la correlación ARN-proteína (Fig. 4a, d y Datos ampliados Fig. 5c). OGDH y SUCLA2 se encontraban entre los genes con los cambios de correlación ARN-proteína dependientes del genotipo más fuertes (Fig. 4d). En particular, encontramos una correlación deficiente entre ARN y proteínas para MMUT tanto en células de control como en células deficientes en MMUT (Fig. 4a, d y Datos ampliados, Fig. 5c).

Finalmente, los niveles de proteína MMUT se correlacionaron positivamente con los niveles de proteína de muchos TCA y enzimas anapleróticas en el control, pero no en las células con deficiencia de MMUT, mientras que hubo poca o ninguna correlación de expresión de proteínas entre las isoformas de proteínas MMUT y no TCA en cualquiera de los genotipos (Fig. 4a centro y datos extendidos Fig. 5d). Dicha relación se ejemplifica con MMUT:ACO2 y MMUT:ACO1 (centro de la Fig. 4a y Fig. 5e de datos ampliados) e indica que MMUT puede ser parte de una red de interacción hasta ahora desconocida con estas enzimas anapleróticas y del ciclo TCA mitocondrial31. El examen de la correlación por pares entre todas las proteínas y transcripciones (Datos ampliados, Fig. 5f, g) en estas vías sugiere que el ciclo de TCA y las enzimas anapleróticas tienen una correlación positiva entre sí, que no se altera en la deficiencia de MMUT a menos que MMUT esté incluido en el comparación. En general, los hallazgos anteriores sugieren que la alteración de la expresión de proteínas y ARN de MMUT impulsa cambios regulatorios en ciertos TCA y enzimas anapleróticas.

Para examinar las consecuencias funcionales de las alteraciones de la expresión de proteínas y ARN anteriores, realizamos un análisis metabolómico no dirigido en un conjunto de seis fibroblastos deficientes en MMUT, derivados de pacientes, y seis fibroblastos primarios de control, derivados de individuos no afectados (criterios de selección en la figura de datos ampliados). .6a y Métodos). Si bien la corriente iónica total fue comparable en las muestras con deficiencia de MMUT y de control (Datos ampliados, Fig. 6b), encontramos una disminución de glutamina y alanina, así como un aumento de hexosas, metilcitrato, oxoadipato, aminoadipato y piruvato entre los metabolitos con cambios más significativos (Fig. .5a). No se observaron cambios fuertes en el tamaño del grupo de intermedios del ciclo de TCA en estas células (Datos ampliados, figura 6c); sin embargo, muchos de los metabolitos alterados representan precursores anapleróticos. Los cambios en los metabolitos anapleróticos son consistentes con los cambios observados en la expresión de ARN y proteínas en los sistemas modelo coincidentes, lo que indica una interrupción de la anaplerosis del ciclo de TCA en la deficiencia de MMUT (Fig. 5b). También sugieren un posible efecto en cadena en las vías adyacentes, como lo ilustra el aumento de oxoadipato y aminoadipato (Fig. 5a). Estos son metabolitos aguas arriba del complejo 2-oxoadipato deshidrogenasa, que comparte sus componentes E2 (DLST) y E3 (DLD) con el complejo 2-oxoglutarato deshidrogenasa (Datos ampliados, Fig. 6d), potencialmente indicativo de una preferencia por el 2-oxoglutarato sobre Metabolismo del 2-oxoadipato en células con deficiencia de MMUT.

a, Gráfico de volcán que representa metabolitos expresados ​​diferencialmente. Se destacan aquellos particularmente relevantes para este estudio. b, Representación esquemática del ciclo del TCA y reacciones anapleróticas relevantes. El código de colores indica desregulaciones en los niveles de metabolitos y proteínas; No se detectaron metabolitos grises. c, Tamaños de los grupos de metabolitos en el control y células CRISPR/Cas9 KO 293T (las barras de error representan sd, centradas alrededor de la media). d, Representación esquemática del etiquetado del ciclo del TCA y metabolitos asociados derivados de la glutamina marcada mediante anaplerosis. Los círculos representan átomos de carbono. e, Abundancia relativa de isotopólogos de los metabolitos del ciclo del TCA después del marcaje con glutamina. f, Relaciones de isotopólogos de citrato M + 5 y M + 4. g, Tamaños totales de los grupos de metabolitos del ciclo del TCA en diferentes condiciones de tratamiento. Oxoglu., dimetil-oxoglutarato. h, Niveles de propionilcarnitina en fibroblastos de pacientes primarios en tratamiento. i, Proporciones de isotopólogos de citrato M+5 y M+4 bajo tratamiento en fibroblastos primarios; Los valores de p se calcularon mediante la prueba de rango de Wilcoxon bilateral. Los elementos del diagrama de caja representan la línea central y la mediana; límites de caja, cuartiles superior e inferior; y bigotes, rango intercuartil 1,5×. Para experimentos en células 293T (c, e – g), se midieron n = 3 muestras biológicamente independientes (WT), n = 2 (MMUT-KO), n = 2 (DLST-KO) en dos experimentos independientes. Para experimentos en fibroblastos de pacientes (h,i), se midieron n = 4 muestras biológicamente independientes por grupo.

Datos fuente

Para estudiar las alteraciones anapleróticas en profundidad, realizamos metabolómica dirigida en células 293T con antecedentes genéticos de tipo salvaje (WT), MMUT knockout (KO) o DLST-KO, según lo validado por análisis de transferencia Western y mediciones de actividad enzimática (Figura complementaria. 5). Se utilizaron células DLST-KO como control adicional para imitar la reducción de la proteína OGDH en la deficiencia de MMUT. En las células MMUT-KO, encontramos intermedios del ciclo de TCA notablemente reducidos, lo que indica una reducción general del grupo de metabolitos de TCA, mientras que KO de DLST condujo a una ausencia virtual de la mayoría de los metabolitos del ciclo de TCA (Fig. 5c). Además, encontramos tamaños de grupo reducidos de glutamina y glutamato (Figura complementaria 6a) comparables a los fibroblastos del paciente (Datos ampliados, Figura 6c). Estos resultados apuntan a una dependencia ajustada de la vía anaplerótica de la glutamina en la enfermedad; una hipótesis que probamos más a fondo al evaluar la incorporación relativa de carbono derivada de la glutamina [U-13C] en el ciclo del TCA y los intermedios asociados (Fig. 5d). Para identificar patrones de etiquetado diferenciales, estudiamos la distribución de isótopos en función de la incorporación relativa de carbonos derivados de glutamina (Figura complementaria 6b) en el ciclo del TCA. En este experimento, el catabolismo anaplerótico inmediato de la glutamina da como resultado compuestos M + 5 (glutamato y oxoglutarato) y M + 4 (succinato, fumarato, malato y citrato), mientras que los ciclos oxidativos del ciclo TCA incorporarán principalmente carbono sin marcar (por ejemplo, de glucosa y metilmalonil-CoA) y 13C diluido derivado de glutamina. En condiciones MMUT-KO, encontramos una tendencia a aumentar las fracciones proporcionales de oxoglutarato M + 5 y los isotopólogos M + 4 de todos los metabolitos del ciclo de TCA estudiados, con fracciones proporcionales reducidas de M + 0 para cada uno (Fig. 5e), como lo ejemplifica succinato (Datos ampliados, Fig. 7a). Esto implica que las células con MMUT alterada tienen un mayor uso de glutamina como fuente anaplerótica. Además, de acuerdo con la actividad reducida de OGDH, hubo una preferencia relativa por la vía reductora del ciclo de TCA, como lo indica un aumento de la proporción M + 5/M + 4 para citrato (Fig. 5d) 32, 33 en la deficiencia de MMUT (Fig. 5f). ). La aplicación de la misma técnica de etiquetado en los fibroblastos del paciente primario y de control replicó el recableado del ciclo de TCA observado (Datos ampliados, figura 7b).

Para probar si la suplementación directa de metabolitos centrales relacionados con el TCA puede corregir los grupos reducidos de intermediarios del ciclo del TCA, volvimos a realizar estudios metabolómicos sin intervención o después de la suplementación con citrato, malato o dimetiloxoglutarato en células 293T y fibroblastos (Fig. 5). y Datos ampliados Fig. 7c). El dimetiloxoglutarato es una alternativa permeable a la membrana al 2-oxoglutarato, utilizado anteriormente en un modelo de disfunción OXPHOS32. La suplementación con citrato y malato aumentó las reservas de los respectivos metabolitos intracelulares, pero no tuvo un impacto amplio en otros intermedios de TCA (Fig. 5g y Datos ampliados, Fig. 7c). Como no separamos los grupos mitocondriales y citosólicos, la mayoría del citrato suplementado puede haber permanecido citosólico, lo que coincide con el área máxima total mejorada en gran medida del citrato M + 0, pero sin cambios en la cantidad de citrato marcado (Datos ampliados, figura 7d). Del mismo modo, el efecto ligeramente más amplio del malato puede reflejar su entrada parcial a las mitocondrias, aunque los grupos de malato etiquetados también se mantuvieron relativamente sin cambios después de la suplementación (Datos ampliados, figura 7e). Por el contrario, el dimetiloxoglutarato, además de aumentar las reservas de oxoglutarato, aumentó el succinato, el malato y el fumarato en las células 293T (Fig. 5g), así como el citrato en los fibroblastos del paciente primario (Datos ampliados, Fig. 7c). Se puede especular que esto se debe a su alta penetrancia en las mitocondrias al enmascarar las cargas negativas con grupos metilo. Estos patrones se vieron reforzados por la investigación de los patrones de etiquetado derivados de la glutamina [U-13C], mediante los cuales la adición de citrato y malato eliminó la contribución de la glutamina a sus respectivos pools, pero no afectó fuertemente la síntesis anaplerótica de otros intermediarios, mientras que el dimetil- El oxoglutarato redujo la contribución anaplerótica de la glutamina a todos los intermedios detectados (Datos ampliados, Fig. 8a, b). Otras dos observaciones hacen del dimetiloxoglutarato un compuesto de tratamiento interesante: en los fibroblastos de pacientes, el dimetiloxoglutarato redujo fuertemente los grupos de propionilcarnitina, un biomarcador de la enfermedad MMA y derivado del metabolito tóxico propionil-CoA (Fig. 5h), y condujo a una tendencia para disminuir la proporción M + 5 / M + 4 para citrato en la deficiencia de MMUT (Fig. 5i), lo que indica una posible estrangulación y reequilibrio del ciclo reductor de TCA bajo este tratamiento.

Los ajustes observados anteriormente en la anaplerosis por glutamina tienen una etiología reguladora poco clara. Sobre la base de la fuerte correlación de expresión de proteínas entre MMUT y el ciclo proximal de TCA y las enzimas anapleróticas (Fig. 4a y Datos ampliados, Fig. 5d), planteamos la hipótesis de que estas proteínas podrían ser parte de un complejo de metabolones compartido, lo que podría facilitar la regulación del ciclo de TCA. anaplerosis de glutamina por interacciones proteína-proteína31. Para obtener información sobre esta posible relación física, aprovechamos la sobreexpresión de versiones C-terminales de MMUT funcionales marcadas con FLAG (Datos extendidos, Fig. 9a), tres miembros de la vía involucrados en el cofactor MMUT (MMAA y MMAB) y el sustrato. Se espera que la síntesis (MCEE) participe en cualquier complejo multiproteico que contenga MMUT y tres controles negativos (vector vacío (EV), VLCAD y ACO2) en células 293T (Fig. 6a). Usando inmunoprecipitación (IP) de reticulación seguida de inmunotransferencia, encontramos que la IP de MMUT, MMAB, MMAA y MCEE sobreexpresados ​​permitió la detección de MMUT y MMAB endógenos (Datos extendidos, Fig. 9b), un resultado confirmado por la detección recíproca de endógenos. MMAB y MMUT (Datos ampliados, figura 9c), lo que indica que estos miembros de la vía eran de hecho parte de un complejo. Por el contrario, la IP después de la expresión de EV, VLCAD y ACO2 no dio como resultado la detección de MMUT y MMAB endógenos (Datos ampliados, figura 9b), lo que demuestra que las interacciones detectadas anteriormente son específicas.

a, Esquema de los grupos experimentales y de control que indican qué proteína se usó con una etiqueta FLAG en un experimento de purificación por afinidad de reticulación junto con el análisis posterior de las muestras desplegables mediante espectrometría de masas. b, diagrama de Venn de proteínas derribadas por las diferentes proteínas marcadas con FLAG. c, valores de ANOVA P (bilaterales) de todas las proteínas eliminadas por MMUT. Los puntos grises indican proteínas con localización mitocondrial, según UniProt. d, Red de interacción de proteínas significativamente enriquecidas (valor ANOVA P <0,05, bilateral). Un conector más grueso indica un valor P más bajo. Azul, proteínas con etiquetas FLAG utilizadas en el menú desplegable; proteínas rojas, significativamente reducidas como se indica en rojo en b que no comparten ningún péptido con los controles negativos; sin color, proteínas significativamente enriquecidas, pero no exclusivamente derribadas por proteínas etiquetadas con FLAG. e, Western blot de IP de MMUT etiquetado con FLAG que busca DLST. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

Datos fuente

Para examinar un complejo potencial con el ciclo de TCA y enzimas anapleróticas, realizamos IP acoplado a espectrometría de masas de las cuatro proteínas de la vía MMUT (MMUT, MMAA, MMAB y MCEE) y dos controles negativos (EV y VLCAD). Con una tasa de descubrimiento falso (FDR) del 1,0% utilizando dos péptidos como mínimo en un umbral del 95%, cada una de estas proteínas "cebo" derribó un total de 100 a 350 proteínas "presa" diferentes en tres réplicas biológicas (Datos ampliados, figura 10a). Dentro de esta intersección, identificamos 37 proteínas presa derribadas por MCEE, MMAA, MMAB y MMUT pero no por EV o VLCAD en ninguna réplica, incluidas MMUT, OGDH, DLST y GOT2, así como 20 proteínas derribadas por MCEE, MMAB y MMUT pero no EV o VLCAD, incluidos MMAB y GLUD1 (Fig. 6b). El análisis de varianza (ANOVA) de los triplicados biológicos que compararon MMUT con EV y VLCAD identificó 22 proteínas que estaban significativamente enriquecidas (valor de P nominal <0,05) en la muestra de MMUT (Fig. 6c y Tabla complementaria 2). UniProt designó todas las proteínas para tener localización mitocondrial e incluyeron GLUD1, GOT2 y DLST (Fig. 6c). ANOVA que compara la intersección de proteínas derribadas con confianza por al menos tres de MMUT, MMAA, MMAB y MCEE, pero ni EV ni VLCAD identificaron 11 proteínas que interactúan, incluidas GLUD1 y GOT2; mientras que la intersección de dos de MMUT, MMAA, MMAB y MCEE pero ningún control negativo identificó 13 proteínas que interactúan, incluida DLST (Fig. 6d y Tabla complementaria 2). Finalmente, la formación de complejos entre MMUT y DLST se confirmó adicionalmente mediante inmunotransferencia (Fig. 6e y Datos ampliados, Fig. 10b). Estos datos indican que MMUT es parte de un complejo de enzimas metabólicas proximales, incluido GLUD1 y el componente del complejo oxoglutarato deshidrogenasa DLST, y sugiere que la interrupción de estas interacciones puede ser la base de su regulación alterada en la enfermedad.

En este estudio, utilizamos un enfoque multimodal integrado para diagnosticar y descubrir mecanismos patogénicos del IEM como MMA. Lo único de esta investigación fue el conjunto relativamente grande de muestras de pacientes y los fenotipos correspondientes disponibles para una enfermedad genética tan rara y la capacidad de coordinar alícuotas de las mismas muestras para generar datos en tres capas moleculares. Los resultados de nuestro estudio alentarán esfuerzos futuros para utilizar nuestro enfoque en cualquier entorno de una enfermedad monogénica congénita. En el futuro, los conjuntos de datos derivados de nuestro estudio se pueden explotar aún más, por ejemplo, aplicando herramientas de contextualización de redes34, integrando modelos multiómicos y de flujo35 y reconstruyendo redes metabólicas a escala genómica36, continuando refinando la cartera de un estudio multimodal de IEM.

Nuestros hallazgos refuerzan el valor de conjuntos de datos completos y complementarios para aumentar el rendimiento diagnóstico y la comprensión de los fundamentos fisiopatológicos de la enfermedad. Nuestro perfil multimodal permitió la identificación de la variación genética causal en el 84% de la cohorte, incluidos factores causales en las muestras sin deficiencia de MMUT. Pudimos ampliar el conjunto de genes más allá de los genes clásicos de MMA MMUT, MMAA y MMAB. Por ejemplo, la identificación de variantes dañinas de ACSF3 en nuestra cohorte es particularmente notable, ya que recientemente se han relacionado con la combinación de malónico y MMA37. El fenotipo de los pacientes con combinación malónica y MMA fue indistinguible del resto de pacientes con MMA con actividad MMUT normal, lo que destaca el hecho de que los IEM se presentan con fenotipos ampliamente superpuestos y que deben estudiarse con grandes paneles de genes o con enfoques WGS para evitar sesgos. hacia genes conocidos y aumentar las posibilidades de diagnóstico.

Si bien la capacidad de la información fenotípica clínica para predecir un diagnóstico molecular era limitada, las variables fenotípicas, tanto clínicas como bioquímicas, permitieron la estratificación de la muestra según la gravedad de la enfermedad y, en consecuencia, la identificación de alteraciones de múltiples niveles de genes/proteínas metabólicas que no eran evidentes después del examen de un solo paciente. capas ómicas. Este alejamiento de los 'silos de datos' hacia un verdadero análisis integrador y basado en mecanismos de múltiples capas sigue siendo un desafío, ya que requiere nuevos métodos analíticos y estadísticos para combinar estos conjuntos de datos dispares38. En esta capacidad, el análisis de factores multiómicos23 destacó la alteración de las transcripciones y proteínas del ciclo de TCA y vías relacionadas, un hallazgo verificado por la correlación con datos fenotípicos que utilizan tanto la actividad de PI como un CSS. Después de la integración multimodal, realizamos metabolómica en células de pacientes seleccionadas y complementamos aún más los datos con estudios de seguimiento de glutamina y de interacción proteína-proteína en un segundo modelo celular. En resumen, estos experimentos mostraron una disminución de las reservas de metabolitos de TCA y un aumento de la anaplerosis derivada de la glutamina. Investigaciones similares en la aciduria propiónica, un trastorno relacionado con el MMA, mostraron un flujo limitado derivado del α-oxoglutarato marcado con 13C39. Además, encontramos candidatos de interacción MMUT no identificados previamente, entre los cuales DLST (componente del complejo OGDH) y GLUD1 están directamente involucrados en la vía anaplerótica de la glutamina. Es de destacar que un conjunto tan personalizado de enfoques experimentales de seguimiento (datos ortogonales a multiómicos) es invaluable para la evaluación molecular de objetivos potenciales y la validación de su importancia biológica.

Nuestros resultados resaltan la importancia de la pérdida de metilmalonil-CoA como fuente anaplerótica e indican una reducción relevante de los intermedios del ciclo del TCA en MMA. Mostramos que la insuficiencia anaplerótica es un patomecanismo relevante de MMA y abordamos este fenómeno como un objetivo terapéutico al tratar ambos modelos celulares con intermediarios del ciclo de TCA. Estos enfoques de estimulación anaplerótica tienen precedentes en los IEM, incluida la aplicación de triheptanoína en los trastornos de oxidación de ácidos grasos de cadena larga40 o el tratamiento con citrato de pacientes que padecen aciduria propiónica, un trastorno relacionado con la MMA41. Nuestros hallazgos ahora muestran que el dimetiloxoglutarato, una alternativa permeable a la membrana al 2-oxoglutarato, utilizada anteriormente en un modelo de disfunción OXPHOS32, puede representar una estrategia terapéutica más prometedora. Los estudios para delinear mejor la eficacia de tales enfoques en modelos preclínicos y clínicos serán importantes para el desarrollo continuo de nuevos tratamientos para MMA y IEM en general.

Aquí, estudiamos una cohorte única de un IEM raro. La cohorte es notable con respecto al número de pacientes incluidos con enfermedades raras, la cantidad de información fenotípica recopilada y la disponibilidad de líneas celulares primarias de fibroblastos para cada individuo de la cohorte; sin embargo, se requieren esfuerzos futuros para incluir a todos los individuos (incluido un número igual de controles) de manera imparcial para evitar el sesgo del colisionador y recopilar datos fenotípicos de manera completa, estandarizada y longitudinal (por ejemplo, a través de registros de enfermedades raras); objetivos que no eran posibles en nuestra cohorte multinacional de varias décadas. Además, será necesaria la corroboración de nuestros hallazgos sobre el recableado del ciclo de TCA en MMA en modelos ortogonales, incluidos estudios in vivo, para evaluar su aplicabilidad en un entorno terapéutico.

Se recolectaron muestras de fibroblastos primarios y la información correspondiente relacionada con la enfermedad, incluidos datos clínicos y de diagnóstico, entre 1989 y 2015. La información obtenida y el uso de fibroblastos permanecen bajo la aprobación ética otorgada por el Comité de Ética del Cantón de Zurich (KEK-2014). -0211, enmienda: PB_2020-00053). Tras la recolección, los fibroblastos primarios se cultivaron usando medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco, Life Technologies) con suero bovino fetal al 10 % (Gibco) y antibióticos (GE Healthcare) y se usaron inmediatamente o se intercambiaron con suero bovino fetal al 90 % y 10 %. dimetilsulfóxido y se almacenan en crioviales bajo nitrógeno líquido. Se envió una alícuota congelada de cada cultivo de células de fibroblastos primarios para análisis WGS, RNA-seq y DIA-MS (Fig. 1a). RNA-seq y DIA-MS siempre se realizaron a partir de alícuotas coincidentes.

Las muestras de los pacientes fueron remitidas a nuestro centro inicialmente con fines de diagnóstico enzimático o genético. Para este estudio, seleccionamos individuos afectados (n = 210) según la presencia de ácido metilmalónico en orina o plasma. Las muestras de pacientes fueron acompañadas de un cuestionario completado por el médico remitente (Documento complementario 1) que contenía datos sobre la presentación clínica y bioquímica de los pacientes. Los datos de fenotipo se proporcionan en los datos de origen de la Fig. 2. Para los análisis que se muestran en la Fig. 2, se utilizan nueve variables fenotípicas (hipotermia, hiperventilación, irritabilidad, somnolencia, vómitos, deshidratación, dificultades de alimentación, respuesta al tratamiento agudo y tasa de filtración glomerular estimada). ) fueron excluidos debido a su naturaleza inespecífica, mientras que los análisis en la Figura 1 complementaria incluyeron información fenotípica completa. Las muestras de control se obtuvieron de individuos sanos o de donantes sin defecto bioquímico cuyo diagnóstico excluyó la MMA.

La puntuación de gravedad de la enfermedad clínica se basó en cinco signos/síntomas clínicos típicos de MMA7, incluida la edad de inicio de la enfermedad, así como la presencia de anomalías neurológicas, insuficiencia renal, anomalías hematológicas y retraso del crecimiento. A cada paciente se le asignó una puntuación de 0 a 5, lo que indica una gravedad cada vez mayor de la enfermedad (datos de origen de la figura 2).

El PI en material precipitable con ácido de fibroblastos primarios se evaluó de acuerdo con un protocolo descrito anteriormente42 con las modificaciones descritas20. El ensayo de actividad enzimática MMUT se realizó en lisados ​​​​de células crudas de fibroblastos como se describió originalmente43,44 utilizando modificaciones recientes8. La actividad de la enzima MMUT en células HEK se midió usando el mismo protocolo pero sin sustrato radiomarcado (en su lugar, solo se usó 1 mM de metilmalonil-CoA, Sigma M1762) y la determinación final de succinato se realizó mediante separación por HPLC y espectrometría de masas en tándem de ionización por electropulverización (ESI) ( MS/MS) (sistema SCIEX TripleQuad 5500 LC–MS/MS).

El ADN genómico se aisló utilizando los reactivos del kit QIAmp DNA Mini (QIAGEN) siguiendo el protocolo proporcionado por el proveedor. Las bibliotecas WGS se prepararon con reactivos de biblioteca sin PCR de ADN TruSeq (Illumina) utilizando 1 μg de ADN genómico siguiendo el protocolo proporcionado por el proveedor. Las bibliotecas de ADN genómico se cuantificaron utilizando el kit completo de cuantificación de bibliotecas KAPA (Roche) de acuerdo con el protocolo suministrado con los reactivos. Las bibliotecas cuantificadas se secuenciaron en el secuenciador NovaSeq 6000 (Illumina) utilizando una configuración de ejecución final emparejada de 150 nucleótidos siguiendo el protocolo proporcionado por el proveedor.

El ARN total se aisló utilizando el kit Rneasy Plus Mini (QIAGEN). Las bibliotecas de RNA-seq se prepararon utilizando los reactivos TruSeq Stranded mRNA-seq (Illumina) utilizando 200 ng de ARN total siguiendo el protocolo proporcionado por el proveedor. La calidad del ARN total y de las bibliotecas de RNA-seq se evaluó en Fragment Analyzer (Agilent). Las bibliotecas se secuenciaron en Illumina HiSeq 4000 utilizando la configuración de ejecución final emparejada de 75 nucleótidos siguiendo el protocolo proporcionado por el proveedor.

Las muestras se procesaron en bloques de ocho, teniendo en cuenta un equilibrio entre los tipos de enfermedades y las muestras de control. Todos los demás factores dentro de un bloque fueron aleatorios. Se procesaron un total de 230 muestras en tres lotes. Para el procesamiento de la muestra, se lavaron dos veces alícuotas de fibroblastos primarios (~1 x 106 células por vial) en PBS enfriado con hielo (Gibco), se resuspendieron en tampón de lisis (Preomics) en una proporción de 1:1 (vol de sedimento/vol de tampón de lisis). ) y se incubaron a 95 °C durante 10 min. Las muestras se sonicaron en un vial de tweeter (Hielscher Ultrasound Technology) a 4 °C durante tres ciclos con una amplitud del 100% y una potencia del 80% durante 30 s. Luego, se procesaron adicionalmente 100 μg de lisado de proteínas con el kit iST (Preomics). Los péptidos purificados se resuspendieron en tampón LCLoad que contenía péptidos iRT (Biognosys) a una concentración de 1 μg μl-1.

Para la generación de bibliotecas espectrales, se combinaron tres veces 24 muestras (3 × 8 bloques de muestras). Los lotes de muestras agrupadas se digirieron como se describe anteriormente. Luego, se fraccionaron 100 µg de péptidos purificados en una columna C18 (YMC-Triart, C18, 3 µm, 250 x 0,5 mm de diámetro interno) según el pH en un sistema Agilent HPLC 1260 con un gradiente escalonado de 61 minutos que oscilaba entre el 95 % tampón A (ácido formiato de amonio 20 mM/H2O) a tampón B al 85 % (formiato de amonio 20 mM/ACN al 90 %). En total, se recolectaron 48 fracciones por muestra y posteriormente se combinaron en 24 fracciones. Las muestras se resuspendieron en ACN al 5 %/FA al 0,1 % y se analizaron en un espectrómetro de masas Q-Exactive HF-X (Thermo Fisher Scientific) en modo DDA. Se aplicaron la misma configuración de nLC 1200 y condiciones de elución en gradiente de fase móvil que para DIA.

Los escaneos completos de MS se adquirieron con una resolución de 60 000 con un objetivo de control automático de ganancia (AGC) de 3 × 106 y un tiempo de inyección máximo de 45 ms en un rango de escaneo de m/z 375 a 1500. Se utilizó un método top-12 dependiente de los datos para HCD MS/MS con una energía de colisión normalizada de 28 a una resolución de 15.000 y una primera masa fija de m/z 100. Los iones precursores se aislaron en una ventana de 1,4 Th y se acumularon. para alcanzar un valor objetivo de AGC de 1 × 105 con un tiempo de inyección máximo de 22 ms. Se excluyeron para la fragmentación los iones precursores con un estado de carga de 1 y 6, así como los isótopos. La exclusión dinámica se estableció en 15 s.

Los archivos sin procesar de DDA se procesaron con Proteome Discoverer (v.2.2) utilizando una base de datos humana UniProt (versión 201804) junto con péptidos iRT (Biognosys) y contaminantes comunes. El flujo de trabajo de procesamiento consistió en nodos SequestHT45 y Amanda46 junto con Percolator47. Se utilizaron los siguientes parámetros de búsqueda para la identificación de proteínas: (1) una tolerancia de masa peptídica de 10 ppm; (2) una tolerancia de masa MS/MS de 0,02 Da; (3) se permitió la búsqueda de péptidos completamente trípticos con hasta dos escisiones perdidas; y (4) la carbamidometilación de cisteína se estableció como modificación fija, la oxidación de metionina y la acetilación N-terminal de proteína se establecieron como modificaciones variables. El percolador se fijó en un deltaCN máximo de 0,05, con un FDR objetivo estricto de 0,01 y un FDR objetivo relajado de 0,05. La biblioteca espectral de Proteome Discoverer se importó a Spectronaut v.12 (Biognosys) utilizando parámetros estándar con FDR de coincidencia de espectro de péptidos de 0,01.

Para el análisis DIA, las muestras se midieron en un espectrómetro de masas Q-Exactive HF (Thermo Fisher Scientific). La fase móvil A consistía en agua de calidad HPLC con 0,1 % (v/v) de ácido fórmico y la fase móvil B consistía en ACN de calidad HPLC con 20 % (v/v) de agua de calidad HPLC y 0,1 % (v/v) de ácido fórmico. ácido. La separación de péptidos se llevó a cabo en una columna ES806, 2 µm, 100 Å, 150 µm de diámetro interno × 150 mm, C18 EASY-Spray (Thermo Fisher Scientific) a una temperatura de 50 °C. Para los análisis LC-MS/MS, se cargaron 2 μg de cada muestra en la columna mediante un sistema Easy-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific). Las muestras se cargaron a 4 µl min-1 con fase móvil A al 100% durante 5 min. La elución del péptido se realizó utilizando el siguiente gradiente (1) 2 % a 8 % de fase móvil B en 4 min; (2) 8 % a 32 % de fase móvil B en 49 min; (3) 32 % a 60 % de fase móvil B en 1 min; y (4) aumentar hasta 98% de fase móvil B en 1 min a 2 µl min-1.

Para la adquisición de DIA en un espectrómetro de masas Q-Exactive HF, aplicamos un método DIA publicado en otro lugar48. En resumen, realizamos una exploración MS1 ​​en un rango de masa de m/z 400–1210 con una resolución de 120 000 con un valor objetivo de AGC de 3 × 106 y con un tiempo de inyección máximo de 50 ms. Para las exploraciones MS/MS, la resolución fue de 30 000 con un valor objetivo de AGC de 1 × 106 y con un tiempo de inyección máximo "Auto". Los iones precursores se aislaron dentro de una ventana de 15 Th y se fragmentaron mediante HCD con energía de colisión normalizada 28. Se definieron un total de 54 ventanas de escaneo MS/MS, intercaladas cada 18 escaneos con un escaneo MS1.

El análisis de datos DIA se realizó en Spectronaut v.12 (Biognosys) utilizando parámetros estándar. Para la identificación, se aplicó un valor de corte de Q de 0,01 tanto al precursor como al nivel de proteína. Se seleccionó el área MS1 para la cuantificación. Los parámetros de cuantificación se establecieron para la cantidad media de péptidos para la cantidad del grupo principal, se seleccionaron los tres péptidos principales para el cálculo de la cantidad de proteínas. El filtrado de datos se estableció en un valor Q escaso, sin imputación. La normalización cruzada se estableció en local. El informe de proteínas para el análisis posterior contenía un informe de información sobre PG.ProteinAccessions, PG.ProteinDescriptions, PG.ProteinNames. PG.Qvalue y PG.Cantidad.

Las pruebas generales de control de calidad revelaron una media de lecturas genómicas alineadas de alta calidad de 8,7 × 108 con una cobertura genómica media de> 38 veces (Datos ampliados, figura 1b). Se obtuvo una media de 3,74 millones de variaciones de un solo nucleótido utilizando Genome Analysis Toolkit49 y DeepVariant50. Los datos de RNA-seq mostraron una puntuación de Phred mediana de> 36,3 en tres o más ciclos (Datos ampliados, Fig. 1c), mientras que los datos de proteómica mostraron una alta reproducibilidad con 2218 proteínas detectadas en al menos el 75% de las muestras (Datos ampliados, Fig. 1d). . Para 9 de las 230 muestras, la extracción de ARN produjo ácido nucleico insuficiente para proceder con la secuenciación del transcriptoma; por lo tanto, estos conjuntos de datos se excluyeron de todos los análisis posteriores (datos transcriptómicos de los ID de muestra 22, 54, 59, 78, 89, 109, 123, 207 y 221).

Para seleccionar líneas celulares para metabolómica, optamos por un diseño equilibrado con diez líneas celulares deficientes en MMUT y diez líneas de control. Se seleccionaron líneas deficientes en MMUT para mostrar una sobreexpresión de GLUD1 y una subexpresión de OGDH, mientras que las líneas de control se eligieron para mostrar el patrón inverso. Ajustamos un modelo de efectos mixtos con PI+ como respuesta, dos efectos fijos para la expresión de GLUD1 y OGDH y un efecto aleatorio con la misma estructura de covarianza que los datos proteómicos después de la normalización de columnas y filas. De las líneas celulares deficientes en MMUT y de control, elegimos diez con el valor predicho más bajo de PI+ y diez con el valor predicho más alto, respectivamente. Los diez primeros clasificados con deficiencia de MMUT (MMA014, MMA092, MMA042, MMA067, MMA093, MMA104, MMA013, MMA030, MMA138 y MMA036) y los diez últimos fibroblastos primarios de control clasificados (MMA219, MMA221, MMA227, MMA222, MMA213, MMA230 , MMA226, MMA228, MMA225 y MMA215) se seleccionaron y cultivaron como se describió anteriormente. Seis líneas primarias de fibroblastos (en negrita arriba) cumplieron con los criterios de crecimiento y fueron seleccionadas para el experimento de metabolómica polar.

Se sembraron un total de 100.000 células por pocillo en una placa de seis pocillos y se cultivaron durante 48 h. Se eliminó el medio y las células se lavaron dos veces con hidrogenocarbonato de amonio (NH4HCO3) 150 mM a pH 7,4. Toda la placa se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido durante 20 segundos y luego se almacenó a -80 °C. Los metabolitos se extrajeron poniendo la placa sobre hielo seco y agregando acetonitrilo:metanol:agua frío (-20 °C) 40:40:20 y se incubaron a -20 °C durante 10 minutos. Se recogió el sobrenadante y se añadió un segundo volumen de acetonitrilo:metanol:agua 40:40:20 y se incubó a -20 °C durante 10 minutos. Las placas se pusieron sobre hielo seco y las células se rasparon mecánicamente y se recogieron. Los tubos de recolección se centrifugaron a 15 000 g durante 2 minutos a 4 ° C, los sobrenadantes se recogieron y almacenaron a -20 ° C antes del análisis metabolómico.

El perfil de metabolitos no dirigidos se realizó mediante análisis de inyección de flujo en un instrumento Agilent 6550 QTOF (Agilent) usando ionización negativa, adquisición de alta resolución de 4 GHz y escaneo en modo MS1 entre m/z 50–1000 a 1,4 Hz51. El disolvente era isopropanol:agua 60:40 suplementado con NH4F 1 mM a pH 9,0, así como hexakis(1H, 1H, 3H-tetrafluoropropoxi)fosfazina 10 nM y ácido tauroclórico 80 nM para la calibración de masas en línea. Los siete lotes se analizaron secuencialmente. Dentro de cada lote, la secuencia de inyección fue aleatoria. Los datos se adquirieron en modo perfil, se centraron y se analizaron con MatLab (Mathworks). Los valores faltantes se completaron mediante recursividad en los datos sin procesar. Tras la identificación de los centroides de consenso en todas las muestras, los iones supuestamente se anotaron mediante patrones isotópicos y de masa precisos. A partir de la base de datos HMDB v.4.0, generamos una lista de iones esperados, incluidos los aductos desprotonados, fluorados y todos los principales que se encuentran en estas condiciones. Se enumeraron todas las fórmulas que coincidían con la masa medida dentro de una tolerancia de masa de 0,001 Da. Como este método no emplea separación cromatográfica ni caracterización MS2 en profundidad, no es posible distinguir entre compuestos con la fórmula molecular idéntica. La confianza de la anotación refleja el nivel 4 pero, en la práctica, en el caso de los intermediarios del metabolismo primario, es mayor porque son los metabolitos más abundantes en las células. La matriz de datos resultante incluyó 1.809 iones que podrían coincidir con los metabolitos desprotonados enumerados en HMDB. Se descartaron todos los picos m/z que no coincidieron o que estaban asociados con aductos o isotopómeros pesados.

El estudio fue aprobado bajo licencia no. 202/2014 de la Oficina Veterinaria Cantonal de Zúrich. La generación del modelo variante Mmut-p.Met698Lys y el cruce con un modelo Mmut-ko/wt se realizó como se describió anteriormente24. Estos ratones, B6.129S1-Mmut×B6-Mmut se generaron sobre un fondo C57BL/6J. Los ratones se alojaron en jaulas con ventilación simple con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y una luz artificial de aproximadamente 40 lux en la jaula. Los animales se mantuvieron bajo humedad controlada (45–55%) y temperatura (21 ± 1 °C) y se alojaron en una unidad libre de patógenos específicos protegida con barrera. Los ratones tuvieron acceso ad libitum a agua potable esterilizada y a una dieta granulada y extruida que contenía 18,5% de proteína y 4,5% de grasa (Kliba-Nafag, 3436).

La orina se recogió por la mañana después de una noche en una jaula metabólica. Se eliminó el sedimento y el sobrenadante se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido. Se recolectaron muestras de tejido de ratones de entre 58 y 63 días. Los animales fueron anestesiados con sevoflurano. Se tomó sangre portal y se mantuvo en hielo para que se coagulara, se centrifugó a 4 °C y se congeló rápidamente en nitrógeno líquido inmediatamente después. Se recogieron el hígado, los riñones, el corazón y el cerebro y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Todas las muestras se almacenaron a -80 ° C antes del análisis.

Las muestras de tejido y fluido corporal del ratón derivadas de cinco ratones hembra Mmut-ki/wt y cinco hembras Mmut-ko/ki se recolectaron como se describió anteriormente y se prepararon como se publicó anteriormente52. El análisis de muestras mediante LC-MS se realizó como se publicó anteriormente53. Los iones se anotaron en metabolitos según la masa exacta en la base de datos KEGG54 considerando [M-H+] y una precisión de masa de 0,01 Da.

Se recogieron muestras de tejido cerebral como se describe anteriormente. Se utilizaron cuatro ratones hembra por grupo de genotipo Mmut-ki/wt y Mmut-ko/ki. El ARN se purificó utilizando un kit DNase (QIAGEN, 79254) junto con el kit QIAmp RNA Blood Mini (QIAGEN, 52304). Las lecturas de RNA-seq se alinearon con STAR-aligner55. Como referencia, utilizamos la compilación del genoma del ratón Ensembl GRCm38. Los valores de expresión genética se calcularon con la función featureCounts del paquete R Rsubread56.

La edición CRISPR-Cas9 se realizó en células 293T (ATCC CRL-3216) como se describe57. La proteína Cas9 se proporcionó como plásmido (PX459-V2.0, Addgene, 62988) y ARN guía (MMUT: ATTCCTTTAGTATATCATTT; OGDH: GACTAGTTCGAACTATGTGG; DLST: AACAGGGGAACTGCCCTCTA) como gBLOCKS58 (IDT Technologies). Las células 293T se transfectaron utilizando un sistema de transfección Neon (Thermo Fisher Scientific) que contenía 100.000 células, 0,6 µg de plásmido Cas9 y 600 ng de ARN guía siguiendo las instrucciones del fabricante. 48 h después de la transfección, se recogieron las células, se diluyeron a 1 célula por 100 µl y se transfirieron a una placa de 96 pocillos a razón de 100 µl por pocillo para la selección clonal. Los clones correctos se confirmaron mediante secuenciación Sanger del ADN genómico.

La extracción de proteínas y la transferencia Western se realizaron como se describió anteriormente59. Los anticuerpos primarios utilizados fueron sondas para las siguientes proteínas: MMUT (Abcam, ab67869, dilución 1:1000, huésped ratón), OGDH (Atlas Antibodies, HPA020347, dilución 1:500, huésped conejo), GLUD (Abcam, ab166618, 1:2000 dilución, huésped conejo) y β-actina (Sigma, A1978, dilución 1:5.000, huésped ratón). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron HRP anti-conejo (Santa Cruz, sc-2357, dilución 1:5000, huésped ratón) y HRP anti-ratón (Santa Cruz, sc-516102, dilución 1:5000, huésped cabra).

Se realizó un ensayo de la actividad de la enzima oxoglutarato deshidrogenasa en clones de células 293T de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sigma-Aldrich, MAK189) detectado utilizando un sistema VICTOR Nivo (PerkinElmer).

Las células 293T o fibroblastos primarios se cultivaron en cubreobjetos recubiertos con poli-l-lisina en DMEM con glucosa 25 mM y l-glutamina 4 mM (Gibco, 11965092), suplementados con 10% de FBS, 1% de antibiótico-antimicótico (Gibco). Para los estudios de tratamiento, se añadió sal disódica de ácido cítrico 1 mM (Sigma, 71635), 2-oxoglutarato de dimetilo 6 mM (Sigma, 349631) o ácido l-málico 1 mM (Sigma, M7397) durante 24 h antes de la recolección de células. Cuatro horas antes de la recolección de células, el medio se cambió a DMEM con glucosa 25 mM sin l-glutamina (Gibco, 11960044) suplementada con FBS al 10%, antibiótico-antimicótico al 1% (Gibco) y glutamina [U-13C] 4 mM (Sigma- Aldrich, 605166). En el momento de la recolección, se eliminó el medio, los cubreobjetos se sumergieron rápidamente en agua bidestilada estéril a 37 °C y se enfriaron en metanol al 80 % a -20 °C. Las células se desecharon en metanol y se centrifugaron a 15.000 g durante 15 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se recogieron, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C antes del análisis LC-MS.

Los sobrenadantes descongelados se liofilizaron durante la noche y se resolubilizaron en 200 µl de tampón de carga (agua y ácido fórmico al 0,5%) en placas de 96 pocillos profundos de fondo estrecho en un agitador (800 rpm, 15 °C, 10 min) para inyección LC-MS. Los metabolitos se separaron utilizando una columna ACQUITY UPLC HSS T3 de 1,8 µm, 100 x 2,1 mm de diámetro interno (Waters) y se eluyeron utilizando el siguiente gradiente del disolvente A (agua, formiato de amonio 5 mM y ácido fórmico al 0,1%) al disolvente B (metanol). , formiato de amonio 5 mM y ácido fórmico al 0,1 %) como sigue: 2 min al 0 % de B; 2–3,5 min a 4% B; 3,5 a 10 min a 45 % B; 10 a 12 minutos hasta 70% B; 12 a 13,5 minutos hasta 100% B; con una meseta isocrática al 100% B durante 2 a 15,5 min y de 15,5 a 16,5 min al 0% B. Después de cada ejecución, la columna se volvió a equilibrar durante 8 min al 100% A con un caudal constante de 0,4 ml min- 1.

Los espectros de masas se adquirieron utilizando una fuente ESI calentada de un espectrómetro de masas preciso y de alta resolución Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific). Los espectros de masas se registraron en modo positivo y negativo con el detector MS en modo de escaneo completo (MS completo) en un rango de escaneo de 50 a 750 m/z con un objetivo AGC de 1 × 106, una resolución Orbitrap de 70 000 y una inyección máxima. tiempo de 80 ms. Los picos se integraron con Xcalibur (v.4.0.27.19, Thermo Fisher Scientific) usando ventanas de 0,01 m/z y 20 s para el tiempo de retención como se determinó previamente usando una biblioteca de estándares. Los parámetros de ESI calentado fueron un caudal de gas envolvente de 35 unidades arbitrarias (AU), un caudal de gas auxiliar de 35 AU, un caudal de gas de barrido de 2 AU, un voltaje de pulverización de 3,5 kV, una temperatura capilar de 350 °C y una temperatura del calentador de gas auxiliar de 350 °C. La configuración del detector para MS completo fue CID en la fuente 0,0 eV; µscans de 1; resolución de 70.000; objetivo AGC de 1 × 106; TI máx. de 35 ms y tipo de datos de espectro, perfil. Los parámetros de integración fueron ICIS Peak Integration, RT más cercano; puntos de suavizado 3; ventana de referencia 40; factor de ruido del área 3; factor de ruido máximo 70; y altura mínima del pico 3,0. El preprocesamiento de datos incluyó la imputación de valores faltantes y la normalización de los estándares internos [2H]3-creatina y [2H]4-ácido cítrico para el modo positivo y negativo, respectivamente. Los experimentos se realizaron en 2 a 3 réplicas clonales, dos réplicas biológicas y tres réplicas técnicas. Cada réplica técnica se ejecutó en modo positivo y negativo.

Las células 293T se cultivaron en DMEM (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Gibco) y antibióticos (GE Healthcare). La transfección transitoria de cada construcción pCDNA3-C-FLAG-LIC se realizó al menos tres veces por separado utilizando Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 48 h después de la transfección, las células se reticularon usando paraformaldehído al 0,5 % (PFA, Sigma-Aldrich) en PBS (Gibco) durante 10 min a temperatura ambiente, la reacción se inactivó con glicina 1,25 M/PBS (Sigma-Aldrich) durante 10 min a 4 °C, las células se centrifugaron durante 5 minutos a 2000 g a 4 °C y el sedimento se resuspendió en tampón de lisis (1% Nonidet P-40, 0,5% desoxicolina, NaCl 150 mM y Tris-HCl 50 mM, pH 7,5; todos Sigma-Aldrich). Los extractos celulares previamente aclarados se inmunoprecipitaron con anti-FLAG M2 (F3165, Sigma-Aldrich), anti-MMUT (ab67869, Abcam) o anti-MMAB (HPA039017, Sigma-Aldrich) usando Dynabeads Protein G (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para la captura por afinidad, todas las muestras se lavaron con PBS y los péptidos se liberaron con tripsina (100 ng µl-1 en HCl 10 mM) y los sobrenadantes se recogieron, secaron y disolvieron en ácido fórmico al 0,1%. Todas las muestras capturadas por afinidad se midieron en un espectrómetro de masas Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific) con una resolución MS1 ​​de 70.000, un objetivo de AGC de 3 × 106 y un tiempo de inyección máximo de 100 ms en un rango de exploración de m/z 350. –1.500. Se utilizó un método top-12 dependiente de los datos para HCD MS/MS con una energía de colisión normalizada de 25 a una resolución de 35.000. Los iones precursores se aislaron en una ventana de 1,2 Th con un valor objetivo de AGC de 1 × 105 con un tiempo de inyección máximo de 120 ms. La exclusión dinámica se estableció en 40 s.

Las muestras se analizaron utilizando Mascot (Matrix Science, v.2.6.2) con la base de datos SwissProt (descargada el 4 de febrero de 2019) asumiendo tripsina con un máximo de dos divisiones erróneas. Se buscó la mascota con una tolerancia de masa de iones de fragmentos de 0,030 Da y una tolerancia de iones originales de 10,0 ppm. La oxidación de la metionina se especificó como una modificación variable. Se utilizó Scaffold (v.Scaffold_5.1.2, Proteome Software) para validar las identificaciones de péptidos y proteínas basadas en MS/MS. Se aceptaron identificaciones de péptidos si podían establecerse con una probabilidad superior al 95,0% mediante el algoritmo Scaffold Local FDR. Se aceptaron identificaciones de proteínas si podían establecerse con una probabilidad superior al 99,0% y contenían al menos dos péptidos identificados.

Para la inmunotransferencia, el procedimiento fue el mismo que el descrito anteriormente con la excepción de que las muestras se detectaron usando anti-FLAG (dilución 1:2000; Sigma-Aldrich), anti-MMUT (dilución 1:500, Abcam), anti-MMAB (1 :dilución 1000, Sigma-Aldrich) o anticuerpos primarios anti-DLST (dilución 1:1000, D22B1, Cell Signaling Technology). Las proteínas indicadas se detectaron mediante anticuerpos secundarios anti-ratón (ab131368, Abcam) o anti-conejo (ab131366, Abcam) marcados con HRP en una dilución de 1:5000.

La llamada de variante corta se realizó con los algoritmos GATK y DeepVariant y se anotó con annovar60. Las variaciones del número de copias (CNV) se llamaron con CNVnator61 con un tamaño de contenedor de 100 y parámetros estándar y se anotaron con AnnotSV62. En primer lugar se investigó la variación en el gen MMUT. Cuando no se identificó ninguna causa genética para el fenotipo con este enfoque (dos eventos inactivadores/dañinos en MMUT), se investigaron otros genes que se sabe que están involucrados en MMA (según informes de la literatura) como un panel de genes virtual. Cuando no se encontró ninguna causa genética en los dos pasos anteriores, se investigaron los genes resaltados por la carga mutacional (genes que albergan variantes patogénicas en toda la cohorte en un patrón autosómico recesivo en dos o más individuos). Finalmente, todas las muestras y controles se utilizaron para ejecutar OUTRIDER21 y se analizaron los genes resaltados como valores atípicos de expresión asociados con fenotipos que se superponen a MMA para confirmar las variantes dañinas identificadas o para explorar más a fondo la variación dañina en ellas.

Las variantes se priorizaron con el siguiente enfoque: primero, cualquier variante de codificación (excluidas las variantes sinónimas) con una frecuencia de GnomAD en todas las poblaciones representadas <0,01, en homocigosidad o heterocigosidad compuesta con otra variante relevante y respaldada por al menos dos lecturas directas y dos inversas y Se evaluaron al menos ocho lecturas de cobertura. En segundo lugar, se consideraron y evaluaron todas las variantes categorizadas mediante la aplicación automática de los criterios ACMG63 por InterVar64 o clasificadas en ClinVar65 como 'patógenas' o 'probablemente patógenas', en homocigosidad o heterocigosidad compuesta con otra variante relevante. En tercer lugar, se evaluaron variantes con puntuaciones dbscSNV_ADA o dbscSNV_RF > 0,6 en la anotación annovar utilizando la base de datos preparada y descrita anteriormente66.

Para las CNV, se investigó a los individuos con una única variante heterocigótica o sin variación en MMUT y los otros genes de interés para detectar la presencia de CNV relevantes que pudieran explicar su fenotipo60.

Para el análisis de expresión diferencial, normalizamos por cuantiles la variable de respuesta (medidas de actividad de PI) para que siga una distribución normal estándar y garantice que se cumpla el supuesto de normalidad. Las matrices de expresión proteómica y RNA-seq se estandarizaron iterativamente por columnas y filas para garantizar la media cero y la varianza unitaria tanto por filas como por columnas67,68. Luego ejecutamos un modelo mixto con el vector de expresión genética utilizado como un efecto fijo y un efecto aleatorio con la misma estructura de covarianza que los datos de expresión después de la normalización de columnas y filas como se describió anteriormente25. Para la inspección de la capa de datos global utilizamos los paquetes MOFA v.1.3.1 (ref. 23), MASS v.7.3-54 (ref. 69) y fgsea v.1.18.0 (ref. 70). MOFA se ejecutó con datos transformados logarítmicamente. El análisis de enriquecimiento genético se realizó utilizando conjuntos de genes descargados de http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp 'Colecciones MSigDB' el 28 de diciembre de 2020. Los circos, incluidos los diagramas de acordes, se crearon utilizando el paquete circlize. v.0.4.13 (ref.71). Se accedió al portal UniProt el 24 de febrero de 2021 para obtener datos de localización de proteínas. El análisis de los datos se realizó utilizando R v.4.1.0.

La recolección y el uso de células de fibroblastos primarios y el consentimiento informado para los datos fenotípicos se realizaron según lo aprobado por el Comité de Ética del Cantón de Zurich (KEK-2014–0211, enmienda PB_2020-00053). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Oficina Veterinaria Cantonal de Zúrich (licencia nº 202/2014).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

El acceso a los datos genómicos y transcriptómicos sin procesar está restringido debido a preocupaciones éticas. Los datos pueden ponerse a disposición de DSF previa solicitud razonable dentro de los 3 meses siguientes a una transferencia de datos establecida, un acuerdo de uso y una aprobación ética. Los datos de proteómica de MS (archivos .raw) se depositaron en el Consorcio ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del repositorio de socios MassIVE (https://massive.ucsd.edu) con los identificadores de conjunto de datos MSV000088791 y PXD038225. Los datos sin procesar de Metabolomics MS para mediciones de fibroblastos humanos se cargaron en el repositorio de datos MassIVE (https://massive.ucsd.edu) con el identificador de conjunto de datos MSV000089082. Los archivos sin procesar de IP-MS se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios de MassIVE (https://massive.ucsd.edu) con el identificador de conjunto de datos MSV000088791. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código informático para el análisis de datos está alojado en un repositorio en la plataforma GitHub y se puede acceder a él en https://github.com/pforny/MMAomics.

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Este proyecto fue financiado por el área de enfoque estratégico del dominio ETH 'Salud personalizada y tecnología relacionada' (https://www.sfa-phrt.ch). Este trabajo recibió apoyo financiero de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (31003A_175779 para MRB y 310030_192505) para DSF) y del Programa Prioritario de Investigación Universitaria de la Universidad de Zurich ITINERARE: Terapias innovadoras en enfermedades raras. PF recibió el apoyo de la subvención Filling the Gap otorgada por la Facultad de Medicina de la Universidad de Zurich, así como por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (P500PB_211038) y la Organización Europea de Biología Molecular (ALTF 263-2022). XB fue financiado parcialmente por fondos básicos de ETH (a GR). RJM contó con el apoyo de Holcim Stiftung Wissen. Reconocemos al Centro de Genómica Funcional de Zurich de la Universidad de Zurich por la secuenciación de ARN de tejidos cerebrales de ratón y el apoyo bioinformático, así como por el apoyo con estudios de isótopos de glutamina.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad de Zurich.

Estos autores contribuyeron igualmente: Patrick Forny, Ximena Bonilla, David Lamparter, Wenguang Shao

Los siguientes autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Gunnar Ratsch, Emmanouil T. Dermitzakis, Bernd Wollscheid, Matthias R. Baumgartner y D. Sean Froese.

División de Metabolismo y Centro de Investigación Infantil, Hospital Infantil Universitario de Zurich, Universidad de Zurich, Zurich, Suiza

Patrick Forny, Tanja Plessl, Caroline Frei, Anna Bingisser, Florian Traversi, Céline Bürer, Merima Forny, Matthias R. Baumgartner y D. Sean Froese

Informática Biomédica, Departamento de Ciencias de la Computación, Instituto Federal Suizo de Tecnología/ETH Zürich, Zurich, Suiza

Ximena Bonilla & Gunnar Rätsch

Centro del Genoma Salud 2030, Ginebra, Suiza

David Lamparter, Keith Harshman, Cedric Howald y Emmanouil T. Dermitzakis

PHRT Swiss Multi-Omics Center, smoc.ethz.ch, Zurich, Suiza

David Lampater, Wenguang Shao, Sandra Goetze, Audrey van Drogen, Keith Harshman, Patrick GA Pedrioli, Ioannis Xenarios, Nicola Zamboni, Emmanouil T. Dermitzakis y Bernd Wollscheid

Instituto de Medicina Traslacional, Departamento de Ciencia y Tecnología de la Salud, Instituto Federal Suizo de Tecnología/ETH Zürich, Zurich, Suiza

Wenguang Shao, Sandra Goetze, Audrey van Drogen, Patrick GA Pedrioli y Bernd Wollscheid

Instituto Suizo de Bioinformática, Lausana, Suiza

Sandra Goetze, Patrick GA Pedrioli, Gunnar Rätsch y Bernd Wollscheid

Departamento de Biología, Instituto de Biología de Sistemas Moleculares, Instituto Federal Suizo de Tecnología/ETH Zürich, Zurich, Suiza

Patrick GA Pedrioli, Jueves Aebersold y Nicola Zamboni

División de Química Clínica, Hospital Infantil Universitario de Zurich, Universidad de Zurich, Zurich, Suiza

Martín Poms

División de Oncología y Centro de Investigación Infantil, Hospital Infantil Universitario de Zurich, Universidad de Zurich, Zurich, Suiza

Sarah Cherkaoui y Raphaël J. Morscher

Departamento de Oncología Pediátrica y del Adolescente, Centro Oncológico Gustave Roussy, Universidad Paris-Saclay, Villejuif, Francia

Sara Cherkaoui

División de Neurología Infantil, Hospital Infantil Universitario de Zurich, Universidad de Zurich, Zurich, Suiza

Lucas Simmons

Centro Agora, Lausana, Suiza

Juan Xenario

Unidad de Informática Médica, Hospital Universitario de Zurich, Zurich, Suiza

Gunnar Ratsch

Centro de IA, ETH Zurich, Zurich, Suiza

Gunnar Ratsch

Departamento de Medicina Genética y Desarrollo, Facultad de Medicina de la Universidad de Ginebra, Ginebra, Suiza

Emmanuel T. Dermitzakis

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La conceptualización estuvo a cargo de IX, RA, GR, ETD, BW, MRB y DSF La metodología estuvo a cargo de PF, XB, DL, WS, TP, MF, LS, CH, RJM, SC, SG, AvD, KH, GR, PP y NZ La investigación y el análisis de datos fueron realizados por PF, XB, DL, WS, TP, CB, CF, AB, SC, MP, SG, PP, FT, NZ, GR y DSF. La redacción del borrador original fue realizada por realizada por PF y DSF La revisión y edición estuvo a cargo de todos los coautores. La visualización estuvo a cargo de PF, XB, DL, WS y CF La supervisión estuvo a cargo de PF, KH, PP, FT, IX, GR, ETD, BW y DSF La administración del proyecto estuvo a cargo de PF y BW La financiación fue adquirida por RA, BW , MRB y DSFXB, DL y WS aparecen ordenados alfabéticamente en la lista de autores.

Correspondencia a Gunnar Ratsch, Emmanuel T. Dermitzakis, Bernd Wollscheid, Matthias R. Baumgartner o D. Sean Froese.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses. ETD trabaja actualmente en GlaxoSmithKline y DL trabaja actualmente en Hoffmann La Roche, y sus contribuciones a este trabajo fueron antes de unirse a las entidades antes mencionadas.

Nature Metabolism agradece a Charles Burant y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal: Ashley Castellanos-Jankiewicz, en colaboración con el equipo de Nature Metabolism.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Histograma de muestras de fibroblastos agrupadas en su año de recolección y gráfico de gofres que ilustra los diferentes grupos de muestras indicados por el código de color. b, Gráficos de violín que ilustran el número promedio de lecturas por muestra (n = 229). Sede, alta calidad. Gráfico de líneas (una línea por muestra) que indica la cobertura del genoma como se resume cuantitativamente en la siguiente tabla. c, Diagramas de caja que indican puntuaciones de calidad de Phred en diferentes números de ciclos. Cada muestra (n = 221) se sometió a 75 ciclos que se agruparon (ver eje x) para mostrar las puntuaciones de Phred por agrupación (bin 1-2, 1206 puntuaciones; 3-5, 1809; 6-10, 3015; 11-20, 6030; 21-50, 18090; > 50, 15075). d, Control de calidad proteómica ilustrado por el número de proteínas detectadas en relación con el porcentaje de proteínas superpuestas (panel superior). Utilizando un umbral de > 50% de proteínas superpuestas, se muestran los coeficientes de variación de n = 2850 proteínas para cada grupo de muestra. Los elementos del diagrama de caja representan la línea central y la mediana; límites de caja, cuartiles superior e inferior; bigotes, rango intercuartil 1,5x; puntos, valores atípicos. Los gráficos de violín representan la distribución de los datos mediante curvas de densidad verticales.

a, Diagrama de dispersión del máximo, que se complementa con adenosilcobalamina (AdoCbl) o hidroxocobalamina (OHCbl), la actividad de la enzima MMUT y el ensayo de incorporación de propionato. b, Diagramas de caja de la actividad de la enzima MMUT con y sin suplementación con AdoCbl medida en muestras de fibroblastos biológicamente independientes (mut0, n = 119; mut-, n = 29; otros MMA, n = 46; no afectados, n = 3). c, Diagramas de caja de la actividad de incorporación de propionato con y sin suplementación con OHCbl medida en muestras de fibroblastos biológicamente independientes (mut0, n = 120; mut-, n = 30; otra MMA, n = 60; no afectada, n = 9). d, Variantes del número de copias ilustradas por recuentos de lectura de ubicaciones específicas del gen MMUT para tres muestras específicas. e, Gráficos de dispersión de la transcripción de MMUT y los niveles de proteína de las muestras con deficiencia de MMUT. Las muestras se indican mediante puntos y se agrupan según el tipo de variación genética bialélica subyacente del gen MMUT (Número de muestras para la transcripción y el gráfico de proteínas, respectivamente: eliminación/eliminación, n = 1/1; sin sentido/sin sentido, n = 63/65; sin sentido/splicing, n = 6/6; sin sentido/truncado, n = 26/30; empalme/splicing, n = 6/6; truncado/splicing, n = 3/3; truncado/truncado, n = 36/37). f, Gráficos de regresión de la transcripción de MMUT y los niveles de proteína versus la actividad de incorporación de propionato y enzima MMUT. g, Igual que f pero excluyendo muestras con combinaciones de alelos MMUT truncado/truncado, empalme/empalme y truncado/empalme. h, Doble cambio de todas las transcripciones y proteínas, respectivamente, al comparar el grupo con deficiencia de MMUT con el resto de las muestras. Los nombres de los genes se clasifican según el logaritmo negativo en base 10 del cambio. Todas las regresiones lineales se calculan según el método de Pearson, valores de P bilaterales; las bandas indican un intervalo de nivel de confianza del 95%. Los elementos del diagrama de caja representan la línea central y la mediana; límites de caja, cuartiles superior e inferior; bigotes, rango intercuartil 1,5x; puntos, valores atípicos.

Gráficos de rango de expresión para a, ACSF3, b, SUCLA2, c, MMAA y d, MMAB y gráficos de volcán de puntuación Z para muestras específicas, aplicando el paquete OUTRIDER R.

a, Gráficos de barras proporcionales de la presencia o ausencia de parámetros clínicos en relación con la puntuación de gravedad clínica. b, Edad de inicio en relación con la puntuación de gravedad clínica. c, Regresión lineal de diversas relaciones de la actividad de incorporación de propionato con variables fenotípicas continuas (método de Pearson, comparaciones bilaterales por pares). d, Comparación de la actividad de incorporación de propionato con variables fenotípicas discretas (valores de P mediante prueba t, comparaciones bilaterales por pares; el número de muestras por diagrama de caja se indica encima del diagrama de caja). Los elementos del diagrama de caja representan la línea central y la mediana; límites de caja, cuartiles superior e inferior; bigotes, rango intercuartil 1,5x. Cada punto representa una muestra/paciente.

a, Histogramas de correlaciones de Pearson en 4318 pares de transcripción-proteína (arriba) y 221 muestras (abajo). b, Gráfico de dispersión de las correlaciones transcripción-proteína positivas y negativas más fuertes (clasificadas según el promedio del coeficiente de correlación de Pearson en el grupo de control y con deficiencia de MMUT). c, Gráficos de correlación de Pearson transcripción-proteína de genes seleccionados relacionados con el ciclo de TCA. d, correlación de Spearman de la proteína MMUT versus una selección del ciclo TCA y proteínas relacionadas y sus isoformas ilustradas en un gráfico de cuerdas para el control (izquierda), muestras deficientes en MMUT (centro) y la diferencia de los dos gráficos anteriores (derecha); El espesor de los enlaces indica el valor nominal del coeficiente de correlación. e, Diagrama de dispersión de la proteína MMUT versus ambas isoformas de aconitasa (ACO1 y ACO2) con regresión lineal mediante correlación de Pearson. f, diagrama de cuerdas que ilustra todas las relaciones correlativas del ciclo de TCA y transcripciones o proteínas relacionadas (g); El espesor de los enlaces indica el valor nominal del coeficiente de correlación de Spearman. Todos los valores de P se calcularon a dos caras.

a, Gráfico de densidad que ilustra un modelo para OGDH y GLUD1 con todas las muestras de fibroblastos clasificadas según tres grupos de muestras. b, Diagramas de caja de la corriente iónica total evaluada en los dos grupos experimentales de fibroblastos primarios 'control' y 'deficientes en MMUT' (n = 6 en cada grupo); Las réplicas técnicas se contraen para representar un punto por línea celular. c, metabolitos de TCA medidos mediante metabolómica polar no dirigida; n = 6 réplicas biológicas. d, Niveles de metabolitos involucrados en los dos pasos enzimáticos catalizados por dos complejos de oxoácido deshidrogenasa (OGDC y OADC) y sus reacciones proximales; La proteína OGDH en verde indica su regulación negativa como se detecta en el conjunto de datos de proteotipado; n = 6 réplicas biológicas. Los elementos del diagrama de caja representan la línea central y la mediana; límites de caja, cuartiles superior e inferior; bigotes, rango intercuartil 1,5x. Todos los valores de P se calculan mediante la prueba de rango de Wilcoxon, bilateral.

a, Incorporación relativa en diferentes isotopólogos de succinato sin tratamiento de células 293T. b, Abundancia relativa de isotopólogos de los metabolitos del ciclo del TCA después del marcaje con glutamina. c, Tamaños totales de los grupos de metabolitos del ciclo del TCA en diferentes condiciones de tratamiento (Oxoglut., dimetiloxoglutarato) en fibroblastos primarios; Se midieron n = 4 muestras biológicamente independientes por grupo. d, El recuento total de iones de citrato y malato (e) se muestra para diferentes isotopólogos bajo tratamiento con citrato y malato, respectivamente. Para cada diagrama de caja que representa los resultados de 293 células T (c, e, f, g), n = 3 muestras biológicamente independientes (WT), n = 2 (MMUT-KO), n = 2 (DLST-KO) en 2 experimentos independientes se midieron. Para experimentos en fibroblastos de pacientes (h, i), se midieron n = 4 muestras biológicamente independientes por grupo; Valores de p calculados mediante la prueba de rango de Wilcoxon, bilateral. Los elementos del diagrama de caja representan la línea central y la mediana; límites de caja, cuartiles superior e inferior; bigotes, rango intercuartil 1,5x; los puntos en a, d y e son valores atípicos, en c muestras individuales.

Células (a, 293T. b, fibroblastos de paciente primario y control) tratadas con los compuestos indicados arriba de las gráficas (DM-Oxog., dimetil-oxoglutarato).

a, actividad de la enzima MMUT utilizando un sustrato radiomarcado en células 293T (los fondos (WT o MMUT-KO) y las construcciones transfectadas se indican en la clave de color; los puntos de datos indican medias de n = 3 experimentos independientes; las barras de error indican SD, centrada alrededor de la media; valores de P calculados mediante prueba t, bilateral. b, transferencias Western de MMUT, MMAB, MMAA y MCEE etiquetados con bandera sobreexpresados, pero no VLCAD, ACO2 y vector vacío (EV). c , Detección de MMUT y MMAB endógenos después de la inmunoprecipitación entrecruzada. Los paneles mostrados son representativos de al menos n = 3 experimentos independientes.

Datos fuente

a, los números indican el recuento de proteínas por intersección después de la espectrometría de masas de purificación por afinidad; Las regiones de Venn están etiquetadas con los nombres de las proteínas cebo con etiquetas de bandera; El gráfico UpSet ilustra la intersección y los tamaños de los conjuntos. b, Inmunoprecipitación de MMUT y MCEE etiquetados con bandera para detectar DLST en líneas celulares 293T WT y MMUT-KO. Los paneles mostrados son representativos de al menos n = 3 experimentos independientes.

Datos fuente

Higos suplementarios. 1 a 6, tablas complementarias 1 y 2 y documento complementario 1.

Fuente de datos de transcriptómica y proteómica.

Datos de fenotipo sin procesar.

Datos de fuente estadística de ratón RNA-seq.

Datos de origen de metabolómica.

Datos desplegables sin procesar.

Western blots sin procesar.

Western blots sin procesar.

Western blots sin procesar.

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Forny, P., Bonilla, X., Lamparter, D. et al. La multiómica integrada revela un recableado anaplerótico en la deficiencia de metilmalonil-CoA mutasa. Nat Metab 5, 80–95 (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-022-00720-8

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Recibido: 11 de abril de 2022

Aceptado: 01 de diciembre de 2022

Publicado: 26 de enero de 2023

Fecha de emisión: enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-022-00720-8

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